發布日期：2019-06-27

導語：

　　3D打印又稱增材制造，正在推動如工程、制造、藝術、教育和醫學等行業的重大創新。3D打印技術可將生物相容的材料、細胞和相關部件組成復雜的活組織，可被應用于再生醫學，以滿足對適合移植的組織和器官的需求。

　　與非生物打印相比，3D生物打印更為復雜：要克服包括材料的選擇、細胞類型、生長和分化因子以及與活細胞敏感性和組織結構相關的技術挑戰。解決這些復雜問題需要綜合來自工程、生物材料科學、細胞生物學、物理學和醫學領域的技術。3D生物打印技術先已被用于多種組織的生成和移植，包括多層皮膚、骨骼、血管移植、氣管夾板、心臟組織和軟骨結構。其他應用包括開發用于研究、藥物發現和毒理學的高通量3D生物打印組織模型。 

　　一、3D生物打印的方法策略 

　　1. 仿生學

　　即對組織或器官的細胞和細胞外成分進行體外復制，復現結構的同時也要保證功能的實現。實現這一過程的關鍵是成功復制特定組織內細胞的功能成分。因此，在進行體外模擬之前，應該研究清楚微環境中具有功能性和支撐性的不同類型細胞排列、溶質和不可溶分子的濃度區間、細胞外基質的構成和生理狀態下的受力情況等各方面因素，而這些又涉及到工程學、圖像學、生物材料、細胞生物學、醫學等多個領域的交叉研究。 

　　2. 自組裝

　　即利用胚胎作為生物組織復制的原材料。由于發育中的組織的早期細胞可自發地產生細胞外基質（ECM）、適當的細胞信號、自主組織以及模式，可以定向形成所需的生物微結構和功能。這種方法不需要支架，僅使用經過融合和細胞組織的自組裝的細胞球體來模擬正在發育的組織。此方法需要對胚胎組織和器官的發生發育機制有深入的了解，并能通過操縱環境來驅動3D生物打印組織中的胚胎生長。

　　3. 微型組織、器官

　　微型組織的概念和前面提到的兩種3D生物打印方法及其相關。首先，器官和組織是由更小的柔性功能單元或者微型組織構成的。比如腎原可以被定義為腎臟組織內最小的功能單元。這些微型組織可以通過合理的設計和自主裝配組成更大的功能組織結構。這其中主要涉及到兩種方法，一種是結合生物學設計和結構將自我組裝的細胞集團，再次組裝成功能性的宏觀組織；另外一種是設計并復制出準確、高分辨率的組織單元，然后再自行組裝成具有生理功能的宏觀組織。比如，各個血管構建模塊單元自我組裝后形成支血管網絡系統。利用3D生物打印可實現功能組織單元的精準復制，再通過微流控系統提供維持功能的養分和信息交換通道的器官芯片，可最終用于體外疫苗、藥物的篩選和疾病模型建立。 

　　要打印出具有多種功能、結構及性能的復雜三維生物結構，可能需要結合上述策略的一種或幾種。另外，生物打印過程中的主要步驟是模型設計、材料和細胞的選擇以及組織結構的打印等。最終打印出來的結構可在體外培養一段時間后移植到體內，或者直接在體外進行下一步分析處理。

 　　二、3D打印過程

　　1. 醫學成像技術與模型設計

　　復制結構和功能復雜、不均一的組織或者器官需要對其各組成成分的空間結構和排列具有完整全面的認識和理解。醫學成像技術可以提供研究對象中細胞、組織、器官和機體水平上的3D結構功能信息。這些技術包括計算機斷層掃描（CT）以及核磁共振技術（MRI）等。計算機輔助設計和計算機輔助制造(CAD-CAM)工具和數學建模則用于復雜組織的成像和結構組成信息的收集和數字化。 

　　CT成像基于不同組織對x射線的不同程度地吸收來進行觀察和診斷。其原理是X射線源繞著物體旋轉，隨著X射線穿透人體，傳感器測量傳輸的光束強度和角度，并將數據記錄匯編、表示為組織小體積的像素整合。這種成像方式產生緊密間隔的組織結構軸向切片，經過表面渲染和立體光刻編輯，可以充分描述組織的結構。 

　　MRI則可以在軟組織中提供較高的空間分辨率，具有對比度強、分辨率高的優點，這對于軟組織成像非常有用。原理是利用核磁共振，強磁場使成像組織中的一小部分細胞核與磁場對齊，原子核能量狀態的變化產生射頻信號，可以用接收線圈測量。 

　　使用造影劑如鋇或碘進行CT掃描，使用氧化鐵、釓或金屬蛋白進行MRI掃描，可以大大提高生物結構的對比度。這些制劑會衰減X射線或增強磁共振信號，而這些信號通常用于突出血管等結構，以增強和周圍環境的對比。 

　　2. 具體打印流程及原理

　　從這些成像方法中獲得原始成像數據后，須經過重建處理才能生成二維橫斷面圖像。這個過程被描述為“分析解剖學”向“合成解剖學”的轉變。利用CAD-CAM和數學建模技術生成器官或組織結構的三維模型和解剖視圖，同時保留可用于體積繪制、體積表示和三維圖像表示的圖像體積信息。 

　　如果目標是精確復制成像器官或組織，可以直接使用二維橫斷面或三維模型進行生物打印。直接復制病人自己的器官不太現實(可能會有一定程度的疾病或損傷)，并且代價昂貴，來源有限，很難進行大規模生產。在這些情況下，基于計算機設計的模型將有助于對器官的解剖結構進行設計、分析和仿真。此外，計算機建模可以幫助預測組織結構的機械和生化特性。迄今為止，CT和MRI數據在再生醫學中最常被用于提供特定的組織尺寸測量數據，以幫助設計生物打印結構。 

將已完成的組織或器官模型與數控生物打印系統相連接，把3D描繪出的模型水平分割成數層2D水平薄片，再輸入進3D生物打印系統中。二維水平切片中包含的解剖和構型信息為生物打印設備提供了逐層沉積指令。生物打印技術的不同也會影響組織和器官的設計。比如一些生物打印系統會沉積連續的材料形成三維結構。另外一些系統則會間斷不連續沉積多種材料。組織設計者必須考慮到生物打印系統的功能和特性。

　　三、生物打印主要方式 

　　生物材料的沉積和制版技術主要有噴墨、微擠壓和激光輔助打印三種。3D生物打印中最重要的因素，即表面分辨率、細胞活力和打印用的生物材料決定這三種方法的特點。

 

　　1. 噴墨生物打印

　　噴墨打印機是非生物和生物應用中最常用的打印機類型。第一個用于生物打印的噴墨打印機是商用的2D墨水打印機的改進版本，墨盒里的墨水被一種生物材料代替，紙被一個升降臺控制。現在基于噴墨打印技術的生物材料是專門為處理和打印生物材料而設計的，其分辨率、精度和速度都在不斷提高。噴墨打印機將液體滴到基材上，基材可以支撐或成為最終結構的一部分。這種范圍在200°C到300°C之間的局部加熱對生物分子的穩定性沒有實質性的影響，比如DNA分子或者或哺乳動物細胞的生存能力或打印后生理功能。

 

　　雖然噴墨打印機打印速度快、成本低、適用范圍廣。然而，細胞和材料暴露在熱應和機械應力下的風險、液滴定向性低、液滴大小不均勻、噴嘴經常堵塞和細胞封裝不可靠，這些都是噴墨打印機的缺點。 

　　噴墨生物打印的另一個常見缺點是，生物材料必須是液態的，才能形成水滴。因此，打印出來的液體必須形成一個具有結構組織和功能的立體結構。使用噴墨生物打印技術的另一個限制是難以實現生物相關的細胞密度。通常，低細胞濃度(小于1000萬個細胞/毫升)用于促進液滴的形成，避免噴嘴堵塞并降低剪切應力。較高的細胞濃度也可能抑制一些水凝膠的交聯機制。 

　　盡管有這些缺點，基于墨汁的生物燒結材料也具有成本低、分辨率高、速度快、與許多生物材料相容等優點。另外，通過改變液滴密度或大小，可以在整個三維結構中引入細胞、材料或生長因子的濃度梯度。由于打印出來呈液滴狀，所以更適合于單個細胞連續打印，從而進行單細胞水平上的研究。 

　　2. 微擠壓式生物打印

　　最常見的非生物3D打印機。其中有一些系統使用多個打印頭，以方便實現幾種材料的連續裝配。全球每年銷售近3萬臺3D打印機，學術機構越來越多地購買和應用微擠壓技術進行組織和器官的工程研究。雖然價格昂貴，但在打印材料方面有更好的分辨率、速度、空間可控性和更大的靈活性。 

　　微擠壓打印機的功能是通過裝配在基板上的一個微擠壓頭來控制的擠壓材料的輸出。微擠壓生產連續的材料而不是斷斷續續的液滴。在CAD-CAM軟件的指導下，將材料的小珠粒在二維空間內沉積，使擠出頭沿z軸移動，沉積層作為下一層的基礎。用于3D生物打印的生物材料擠出最常用的方法是氣動或機械(活塞或螺釘)點膠系統。氣動打印機的優點是具有更簡單的驅動機構組件，其力僅受系統的氣壓能力的限制。機械驅動的機構有更小和更復雜的組件，提供更大的空間控制，但會降低承受力的上限。 

　　許多材料都與微擠壓打印機兼容，包括水凝膠、生物相容共聚物和細胞球體等材料。對于微擠壓式打印機，研究人員經常開發可以熱交聯和/或具有薄層性能的材料。一些生物相容的材料可以在室溫下流動，這使得它們與其他生物成分一起擠出，但在體溫下交聯成穩定的材料。微擠壓系統的高分辨率允許生物打印機精確地制造一些較為復雜的結構，并促進多細胞模式的打印。

　　微擠壓生物打印技術的主要優點是能夠沉積非常高的細胞密度。在組織工程器官中實現生理細胞密度是生物打印領域的一個主要目標。一些研究小組使用僅由細胞組成的溶液，通過微擠壓打印技術創建出了一些三維組織結構。尤其是無支架的組織結構進行生物打印最常用的技術就是機械微擠壓技術。微擠壓生物打印后細胞存活率低于噴墨生物打印。細胞存活率在40%-86%左右，隨著擠壓壓力的增大和噴嘴壓力的增大，細胞存活率逐漸降低。微擠壓沉積的細胞存活率下降可能是由于黏性流體中細胞受到剪應力的作用。擠壓力對細胞活力的影響可能比噴嘴剪切力更大，使用低壓和大噴嘴大小雖然可以保持較高的細胞活力，但缺點可能損失其打印的分辨率和打印速度，而維持高存活率是實現組織功能的關鍵。雖然許多研究報告了打印后細胞存活能力的維持，但重要的是研究人員要證明這些細胞不僅存活，而且在組織結構中發揮其基本功能。 

微擠壓生物打印已被用于制造多種組織類型，包括主動脈瓣、分支維管樹和體外藥動學以及腫瘤模型。雖然對于高分辨率的復雜結構來說，制造時間可能會較慢，但已經制造出了從臨床相關的組織到微流體室中的微組織等各種結構。 

　　3. 激光輔助生物打印（LAB）

　　基于激光誘導的正向轉移這一原理。激光誘導正向轉移技術最初是用來轉移金屬的，目前已成功地應用于多肽、DNA和細胞等生物材料。雖然不像噴墨或微擠壓生物打印那么常見，但正在被越來越多地應用于組織和器官工程研究中。這種打印機的工作原理是利用聚焦激光脈沖在色帶的吸收層上產生一個高壓氣泡，將含有細胞的材料推向下面的集電極基板。LAB的打印分辨率受許多因素的影響，包括激光強度(單位面積的能量傳遞)、表面張力、襯底的潤濕性以及生物層的厚度和粘度等。由于LAB是無噴嘴型的，所以困擾其他生物打印方式的細胞或材料堵塞問題在LAB中可以有效避免。LAB中細胞沉積密度高達108個（細胞/毫升），微尺度分辨率為單個細胞每滴，激光脈沖重復頻率為5kHz，打印速度則高達1600毫米/秒。對于細胞打印來說效率是非常高的。 

　　每個打印單元或水凝膠類型通常都需要準備單獨的色帶，這個準備過程會非常耗時，并且如果多個單元類型和/或材料必須同時沉積，則這些單元的組合打印可能也會非常麻煩。另外，由于帶狀細胞涂層的性質，很難準確地定位細胞。其中一些挑戰可以通過使用細胞識別掃描技術來克服，使激光束能夠在每個脈沖中選擇一個細胞。這種所謂的“aim-and-shoot”程序可以確保每個打印的液滴包含預先定義的細胞數量。最后，由于印刷過程中金屬激光吸收層的蒸發，金屬殘留物出現在最終的生物打印結構中。避免這種污染的方法包括使用非金屬吸收層和修改印刷工藝，使之不需要可吸收層。這些系統的高成本也是組織工程基礎研究的一個亟待解決的問題，但是與其他3D打印技術一樣，這些需求成本正在隨著科研技術的發展而迅速下降。

 　　體內LAB的應用試驗已經用于在小鼠顱骨三維缺陷模型中進行納米羥基磷灰石的打印沉積中。另外，激光3D打印已經被用于制造醫療設備，比如定制的、非細胞的、生物可吸收的氣管夾板，相應產品已經被植入一名患有局部氣管支氣管軟化癥的年輕患者體內。未來的研究可能會使用可以直接整合到病人組織中的生物相容性材料。 

　　結語： 

　　3D生物打印組織結構不僅可以用于移植，而且還可以用于新型藥物的發現，化學、生物和毒性分析以及相關的基礎研究。隨著研究人員不斷提高打印組織的復雜性，從二維組織，如皮膚，通過中空的管道如血管，中空的非管狀器官如膀胱以及整個器官如腎臟，這方面的研究工作者將不得不應對日益艱巨的挑戰，包括細胞和材料的需求，組織的生長和功能，以及適當的血管化和神經支配等要求。這些挑戰需要多學科交叉的研究來應對，3D生物打印技術將具有改造再生醫學領域發展速度和深度的無限潛力。

來源：思宇醫械觀察