發布日期：2017-12-28

在中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學課題組用于研究的養豬場里，生活著一群特別的豬。這里不僅有十幾頭帶有基因剪刀的工具豬，而且擁有六七百頭其他在生物醫藥領域具有重要應用價值的基因修飾豬。而這些豬的用途聽起來更加“駭人”，有些基因修飾豬可以模擬人類疾病，如老年癡呆癥、漸凍人癥和亨廷頓舞蹈癥等，有些豬可為人體器官移植提供異種器官來源。

異種器官移植一直是國際研究的重點方向之一。如果這一重大難關能夠攻克，將會為全世界需要器官移植的上百萬病人帶來希望。

令人興奮的是，這道通往希望的大門正在悄然打開——不久前，賴良學課題組在國際權威雜志《基因組研究》上發表了一篇關于構建了條件性表達Cas9基因新型工具豬模型的論文。

廣州生物院首次培育出的帶有基因剪刀的工具豬 廣州生物院首次培育出的帶有基因剪刀的工具豬

為何選擇豬

要了解這項研究，先得從Cas9基因說起。

Cas9基因與CRISPR技術曾經在寨卡病毒暴發時大顯身手，被用于監測寨卡病毒，甚至還能用來檢測SARS、SARS冠狀病毒、麻疹病毒、流感病毒、丙肝病毒等。前者是基因中的一種核酸酶，后者則是“規律成簇間隔短回文重復”的英文縮寫，來自細菌體內，肩負著細菌免疫的“重任”。

在CRISPR利用病毒DNA自行轉化后驅逐這種病毒的過程中，Cas9是關鍵的核酸酶。不過這次，兩者聯手卻不是要檢測病毒，而是被研究人員在豬身上“埋入”一個可以世代遺傳的“秘密”，讓它肩負起更大的使命。

這個秘密就是研究人員通過定點修改豬的基因組，為實驗打開“方便之門”。

一直以來，醫學技術的進步離不開實驗動物的犧牲。這是因為要獲得有關生物學、醫學等方面的新知識或解決具體問題，人類無法在自身上實驗，只能在實驗室使用動物進行科學研究。

在用于實驗的動物中，既有小鼠、大鼠、兔子等小動物，也有豬、猩猩、狒狒等大動物。不過，因為大動物的孕育期、生長期和性成熟期較長，不如小鼠、大鼠、兔子等小動物繁殖時間短。“如果做基因實驗，就需要在胚胎期間更改基因，再放入代孕母體內，等待降生。”賴良學告訴《中國科學報》記者，“小鼠的孕期是21天，4周可性成熟，繼續繁殖下一代。但豬的孕期就有114天左右，性成熟期則需要6~8個月。”所以研究人員往往會選擇孕育期較短的小型動物，以便早日看到實驗結果。

只是，使用小型動物雖然縮短了時間，卻因為小型動物與人體的差別較大，所以實驗結果往往無法直接用在人身上。那么誰可以肩負重任，與人類相近，讓實驗更接近于真實呢？

在眾多哺乳動物中，豬雖然與人的血緣不近，但其器官大小、形態結構、生理代謝和免疫系統等與人類非常接近；再者，豬是人類飼養的家畜，數量比狒狒、猩猩等靈長類動物更多，沒有倫理方面的障礙，所以豬是目前比較理想的實驗動物。

但問題是，如果想根據實驗目的敲掉其中特定基因，研究人員又必須從動物胚胎期開始實施，待到動物被孕育出來才能進行實驗。這樣不僅延長了實驗時間，而且因為培育過程復雜，成功率比較低，導致開銷很大。

從事基因修飾克隆豬研究近20年的賴良學，意識到如果培育一種能夠在體內直接進行基因編輯的工具豬就可以解決上述問題。

2018（第二屆）模式動物與重大疾病動物模型研究與應用研討會

中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院博士、論文第一作者王可品在接受《中國科學報》記者采訪時解釋說：“我們設想可以通過基因編輯技術，將能夠切割基因組的蛋白基因加入到豬的基因組，這樣就等于在豬的體內插入了一把基因剪刀。”而且，通過體細胞克隆獲得這種帶有基因剪刀的第一代工具豬，還能通過簡單的配種實現世代遺傳，形成帶有基因剪刀的豬種群。這樣實驗人員就可直接在成年豬身上做實驗，而不必再從胚胎期做起，從而簡化并大大地加快實驗流程。

四年的堅守

找到了研究方向后，2013年，賴良學又帶領團隊巧妙地設計了實驗方案，接下來的任務，便是向著目標不斷前行。

在實驗過程中，研究人員利用基因打靶技術，將能夠剪開基因的Cas9蛋白基因插入到豬基因組的特定位點ROSA26。“Cas9蛋白作為剪刀，預先埋入豬基因中。不過為了防止Cas9亂剪，所以又加入了開關。”賴良學解釋說。

控制這一開關的關鍵是Cre重組酶。Cre（Cyclization Recombination Enzyme，即環化重組酶）是來源于噬菌體P1的一種酶蛋白，它可以識別催化基因中兩個LoxP位點之間發生同源重組，從而造成DNA的缺失、易位等現象。這一特性在基因工程操作中得到廣泛的應用，尤其在誘導型基因剔除小鼠的建立中應用得十分成功。

那么，將這一技術應用到豬身上能否獲得成功呢？“我們做得很順利，因為我們當時實驗設計得比較好，所以第一代豬孕育出來時就得到了想要的結果。”賴良學回憶說。

其實，實驗之所以如此順利，也得益于賴良學多年的“修煉”。他自2007年回國之后，一直從事基因修飾豬模型的構建，在這以前在多種基因修飾豬方面都取得了重大突破，良好的基礎保證了此工具豬實驗的順利進行。

王可品是賴良學課題組一名碩博連讀的研究生，他還清晰地記得，2015年4月份的一天，克隆的工具豬誕生。“小豬生出來是下午兩三點，我們需要通過分子實驗來驗證小豬是否是我們需要的工具豬。”為了盡快得到實驗結果，王可品與其他研究人員一起在實驗室中進行鑒定。

那一夜注定無眠。王可品和同事從下午一直忙碌到第二天清晨九點，當實驗結果顯示為陽性時，他們特別興奮——他們成功了！

不論是第一代，還是由之繁殖起來的后代工具豬，外表和其他功能與正常家豬并無不同。“它們不會出現特異性疾病。”賴良學說。

關鍵是，在配種時，如果公豬與母豬只有一方進行了基因修飾，那么后代并非所有都會呈現陽性；如果公豬與母豬雙方都完成了基因修飾，那么所孕育的全部后代會100%繼承這一基因。

這意味著，實驗人員在使用工具豬進行實驗時，不需要每次都對豬的基因組進行修飾，只需要在第一代即F0代豬的基因組特定位點插入Cas9蛋白基因，就可以依靠豬的自然繁殖得到同等類型的“天生自帶基因剪刀”的豬，即工具豬。

這只是開始

在等待工具豬的繁育結果過程中，賴良學還將這一技術用在狗身上。2015年，賴良學帶領另一隊研究人員，在狗的胚胎期使用了同樣的方法，即敲掉了其中的一部分基因。這讓被孕育出的小狗呈現出肌肉更發達、運動能力更強的特點。

因為狗在營養代謝、生理解剖、心血管系統等方面與人類極其相似，且狗較為聰明，所以會被用來進行行為學研究，適合建立帕金森氏綜合征、老年癡呆等狗模型來研究人類疾病。當然，狗作為寵物，通過基因敲除來研究培育還可以用來優良遺傳性狀。

在工具豬繁育出后代以后，賴良學團隊的研究人員又圍繞其潛在的應用價值展開了研究。他們首先想到的是利用基因剪刀工具豬制備原發性癌癥模型。

以前制備用于腫瘤發病機制研究和藥物研發的腫瘤模型大多是將人的腫瘤細胞移植到裸鼠體內來實現的。“裸鼠是在胚胎期完全敲掉所有與免疫力相關的基因誕生的鼠類，即一出生就不帶任何免疫力。”賴良學進一步解釋說，“以這種方式制備的小鼠腫瘤模型，一方面因為沒有免疫能力，另一方面，不是原發性腫瘤，因此與人體腫瘤的發生發展有很大的差別，用它對腫瘤藥物進行有效性和安全性檢測的結果95%以上不能轉化為臨床應用。”

研究人員將包裝含有Cre重組酶和靶向六種腫瘤相關基因的gRNAs慢病毒通過滴鼻方式，感染工具豬的肺臟，即讓豬肺細胞的基因組發生癌化突變。果然，三個月后，該工具豬出現了典型的肺癌癥狀和病理變化，從而成功地建立了原發性肺腫瘤大動物模型。

“這種工具豬可在癌癥研究中發揮重要作用，因為癌癥本身就是基因突變。”賴良學解釋說。也因此，人體身上的其他癌癥也可以通過類似的方式作用在工具豬上被復制出。

“以前，一個大型動物的實驗就需要花費上百萬元，現在有了工具豬，不僅縮短了時間，費用降低到幾萬元即可。”賴良學表示。

讓異體移植離臨床更近

無疑，賴良學團隊的研究使異種器官移植往前邁入一大步。

眾所周知，異種器官移植是國際研究的重點方向之一。2015年，美國哈佛大學的中美研究人員在美國《科學》雜志網絡版上發表報告說，他們利用一種新的基因編輯技術，剔除了豬基因組中可能有害的病毒基因，從而攻克豬器官用于人體移植的一個重大難關，為需要器官移植的病人帶來希望。

這是因為豬基因組中大約有11%的重復元件（PRE-1），這一比例與靈長類動物的重復元件副本幾乎相同。有研究人員在《自然》雜志上發表的研究報告稱，這些豬重復元件的結構和功能非常類似于靈長類動物的重復元件副本，暗示人類和豬之間存在比之前所認為的關系親近得多。

現在，賴良學利用CRISPR/Cas9技術，對豬的基因進行改造，獲得了多種免疫源性與人體更為接近的基因修飾豬，大大降低了人體異種器官的排斥反應，讓異體移植距離臨床越來越近。

另外，他們也在探索利用基因編輯豬和多能性干細胞技術培育人體器官的可能性，“比如，胰臟的發育由一個關鍵基因控制，即PDX1基因，所以我們只需敲掉這個基因就可以讓豬不生長自己的胰臟。再在胚胎期，將人全能性干細胞注射到早期發育的胚胎，理論上，生出來的豬的胰臟就全部來自于人的細胞，那么豬長大后的胰臟與人的就可以匹配。”賴良學舉例說。

這并非空穴來風，2016年，美國加利福尼亞大學戴維斯分校的研究團隊就正試圖透過向豬的胚胎注入人類干細胞，來培植出可供人體移植的器官，并希望這些“嵌合體”胚胎能為緩解世界移植器官緊缺問題提供答案。

工具豬、培育人體器官的豬……這些都是賴良學團隊的研究內容，他將CRISPR/Cas9技術不斷加入自己的理解。“現在我的學生們已經青出于藍，他們的討論總是能緊跟世界科技前沿動態。”這讓賴良學更為激動。

2016年，完成博士論文的王可品選擇留在了賴良學的團隊，他希望未來可以利用大動物基因修飾模型為生命科學和醫學作出更多貢獻。

來源：中國科學報