發布日期：2017-09-06
頭頸部腫瘤包括頸部腫瘤、耳鼻喉科腫瘤以及口腔頜面部腫瘤三大部分。比較常見的是甲狀腺腫瘤，喉癌、副鼻竇癌及各種口腔癌（如舌癌、牙齦癌、頰癌等：見圖1）。因此，頭頸部腫瘤的原發部位與病理類型居全身腫瘤之首。同時，頭頸部重要器官比較集中，解剖關系復雜，治療方法各異。據WHO評估，我國近年頭頸部腫瘤的年發病率為每10萬人中15.22人次（15.22/10萬），占全身惡性腫瘤的4.45%。按部位（圖2所示），頭頸腫瘤的發病依次為喉(32.1%)、甲狀腺(19.6%)、口腔(16.1%)、鼻咽(14.9%)、鼻腔副鼻竇(6.6%)、大涎腺(4.2%)、口腔(3.3%)、眼(1.52%)、下咽(1.5%)。在性別上，除甲狀腺腫瘤女性(14.2%)明顯多于男性(5.40%)外，其余以男性居多。其病因尚未查清，有人認為與遺傳因素有關；長期接觸有害的化學氣體及吸煙，亦為誘發因素之一。
圖1：頭頸部淋巴結與組織示意圖（源自中國醫學科學院腫瘤醫院頭頸部腫瘤放射治療圖譜）
圖2：頭頸部腫瘤病灶部位和頻率統計
循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指從原發性實體瘤或轉移灶釋放，突破血管從而進入外周循環血的腫瘤細胞。由于CTCs的稀有性，抗原異質性而難以富集/捕獲，研究者早期主要致力于CTCs的富集與捕獲。目前CTCs已成為多種類型癌癥，如乳腺癌，肺癌，前列腺癌和結腸直腸癌對于良、惡性腫瘤的鑒別有一定的提示價值。美晶醫療與寧波市第二醫院放化療科，李惠利東部醫院及寧波七院胃腸外科的臨床合作中對不能手術或不愿手術的局部進展期胃癌患者進行同步放化療,并觀察療效和不良反應,取得了較好的效果，發現CTCs在胃癌的預后評估及個體化治療，療效監控等方面具有重要的臨床意義。但CTC在頭頸部腫瘤中的研究相對較少。本文主要從CTCs的特性、檢測手段及其在頭頸部腫瘤中的應用進行概述。
1．循環腫瘤細胞的特性與檢測手段
自1869年Ashworth首次報道外周血循環腫瘤細胞（circulating tumor cell ,CTCs)的發現以來，關于CTCs的出現是”腫瘤轉移擴散“還是僅為原發病灶脫離的”單純腫瘤細胞“的問題已經討論了近半個世紀之久。在過去的10數年，伴隨著分子病理學，免疫細胞組化等高敏技術的誕生，又重新燃起了CTCs臨床意義的研究熱潮。1996年Abati【3】等提出盡管外周血中僅有非常少的一部分CTC能存活下來并形成轉移灶，但是CTC的存在就可能為轉移額發生提供了基礎，且近年的許多研究證實CTC的出現與患者的預后呈正向相關，美國德州大學MD Adeson病院的Christfani等數個研究團隊證明，乳腺癌，結直腸癌患者CTC輔助臨床診斷可以作為一個獨立的預后指標。
腫瘤細胞從原發灶生長至發生轉移與其他惡性腫瘤往往經歷原發灶的原位生長（原位癌）、突破基底膜成為浸潤癌、腫瘤細胞突破血管內皮細胞從而進入血液循環、隨血液在全身播散的腫瘤細胞滯留于遠處器官的毛細血管、在轉移灶的定植和生長等惡性行為。在這一過程中，CTCs被認為與惡性腫瘤的復發、轉移密切相關，因其對腫瘤的早期診斷、臨床分期、復發轉移和耐藥監測、預后判斷、開發新的治療靶點具有重要價值。2012年德國海德堡大學普外科臟器與移植專業的Steiner團隊在Langenbecks Arch Surg上發表的研究指出【4】，每克原發腫瘤灶或轉移灶每天約有106個CTC脫落進入外周血循環，而90%的CTC因為人體的免疫調節系統和自身凋亡而失去活力，且CTC在外周血細胞中陽性率較低，與正常血細胞的比值約千萬分之一到億分之一之間。
目前CTCs檢測技術主要分為物理學模式（如以細胞大小差異和過濾為基礎的方法等），正向/負向篩選模式或借助微流控芯片（CTC-Chip）。作為中國自主研發的自動化循環腫瘤細胞檢測系統，美晶醫療CellRichTM循環腫瘤細胞檢測系統采用免疫納米磁顆粒并結合先進的微流體芯片設計專利技術對微量細胞進行捕獲和分析，是一種先進的循環腫瘤細胞檢測與分析平臺。該平臺具備正負向細胞篩選模式：在正向篩選模式中，通過將循環腫瘤細胞上的特異抗原與納米磁顆粒上的特異性抗體相結合，借助微流控專利技術使得含有腫瘤細胞的生物樣本通過梯度磁場，從而將循環腫瘤細胞從血液或其他背景液中篩選出來。在負向篩選模式中，通過對生物體液樣本進行紅細胞裂解處理，配合使用與白細胞、紅細胞或血小板等特異性結合的免疫微珠等技術手段將循環腫瘤細胞之外的細胞進行去除，從而消除背景干擾對循環腫瘤細胞進行檢測的技術手段。而此檢測技術開發完成后，將與現有循環腫瘤細胞檢測系統形成良好的互補和完善。更多細節詳見美晶醫療轉化醫學網4月刊的基于微芯片的自動化循環腫瘤細胞檢測系統?CellRichTM新型液體活檢平臺。其臨床檢測模式以iFISH（原位熒光雜交），免疫熒光及PCR法應用較多，常見的有細胞角蛋白CK19；CK20；癌胚抗原（CEA）；Suivivin；Stanniocaclcin2；MicroRNA-21；各類人類染色體組（如CEP7,CEP8）等。目前，其在臨床應用中最大的限制就是，缺乏特別明確的特異性標志物，以上問題導致當前CTC的研究停滯在原始階段，對CTC的單細胞特性、分子標記物的種類及性質的理解均不充分，距離臨床腫瘤病癥診療的轉化應用仍然有距離。
2．循環腫瘤細胞在頭頸部腫瘤中的應用
頭頸部腫瘤與其它腫瘤（如乳腺癌，前列腺癌或結直腸癌）相比，過去一直認為其預后主要取決于局部復發和區域性的淋巴轉移，其遠處轉移的發生率僅在1%左右，因此關于CTC的臨床研究相對較少。然而伴隨著ICC（免疫熒光檢測），iFISH, PCR等高敏感，高特異性檢測技術的發現與應用，又重新激起了對CTC臨床意義的研究興趣。近年許多研究證明CTC的出現不僅與患者的預后相關，還與腫瘤的組織學分級，腫瘤大小和淋巴結轉移情況包括有無遠處轉移相關聯。Wollenbergtm，Funke，Pajonk【6】等團隊發表的多篇回顧性文獻對于頭頸部腫瘤遠處轉移的共識是：1）20世紀90年代，Berget等采用傳統的酶免檢測（例如堿性磷酸酶（AP）；C26或EMA單抗的免疫熒光檢測（IF）；生物素-鏈酶親和素架橋的辣根過氧化物酶（AB-PCX)模式；生物素-鏈酶親和素架橋的堿性磷酸酶（AB-AP）模式等）幾乎很難檢測到目標的CTCs（表1：酶免檢測在CTCs中的應用（引用自：Funke I and Schraut W. J Clin Oncol. 1998 Feb;16(2):557-66.）；2）伴隨著分子病理學，免疫細胞組化等高敏技術的誕生，外周血模擬試驗中質控細胞的捕獲率已可達到95%及以上（圖3：質控細胞捕獲效率）；3）頭頸部腫瘤是一種全身性疾病，患者的遠處轉移往往發生在腫瘤分級的中后期，而且預示著不良的預后。因此認為遠處轉移的早期診斷對頭頸部腫瘤的預后至關重要，且遠處轉利的高發生率與更短的生存期（OS)明顯相關（圖4：CTCs與預后的關聯：引用自：PLoS One. 2014 Aug 8）
近期寧波第七人民醫院副院長兼外三科主任郝敬鐸醫師近日在寧波市惠民計劃的贊助下，運用美晶醫療的CellRichTM新型液體活檢平臺對轉移性腫瘤（入組數十例結直腸癌，前列腺癌，乳腺癌及頭頸部腫瘤）患者實施CTCs檢測時發現，在早期腫瘤患者中，利用影像學還未發現病灶時已經可以在外周血中檢測到CTCs。研究表明，在疾病的早期，外周血循環腫瘤細胞對于良、惡性腫瘤的鑒別有一定的提示價值，也有助于轉移風險的預測和判斷；在疾病進展和治療過程中，外周血循環腫瘤細胞能為動態檢測病情、耐藥性等臨床診療的關鍵因素提供重要信息，有助于醫師開展個性化的腫瘤治療。
3．循環腫瘤細胞在頭頸部鱗狀細胞癌中的應用
頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma: SCCHN)是頭頸部最常見的惡性腫瘤，約占頭頸惡性腫瘤的90%，占全身惡性腫瘤的10%。WHO統計，全球每年新增病例約65萬例，治療方式從單一手術轉變為手術，放化療，分子靶向治療等多學科聯合模式，任然有50-60%的患者出現原位復發，區域淋巴結轉移，約有20%的患者發現遠處轉移，其5年生存率在50%左右，且近幾十年來沒有顯著提高。因此CTCs做為可評估HNSCC的早期檢測及預后的檢測指標，而備受關注【7,8】。
2010年美國俄亥俄州國立兒童醫院頭頸部腫瘤外科Jatana團隊【9】對48例HNSCC術后患者的血液樣本進行CTCs計數分析，隨訪19個月后發現沒有檢測出CTCs的患者無病生存率明顯高于檢測出CTCs的患者，兩組之間差異有統計學意義（P=0.01）。CTCs與患者年齡、性別、腫瘤位置（口腔、口咽、喉咽、喉）、腫瘤分期、是否加輔助治療均無相關性，認為CTCs可以做為HNSCC預后不良的獨立危險因素。
其后意大利巴倫西亞大學腫瘤醫學科的Grisanti研究組在2014年發現，當CTCs數量》2個時，HNSCC患者的預后比CTCs數量為0-1個的患者更差，患者的疾病無進展生存率與總生存率也更差。經過治療后8%的CTCs陽性患者得到了控制（見圖5：化療前后CTCs數量變化與預后關聯）。該實驗結果刊登在2014年注明期刊Pos One【10】。
圖5：化療前后CTCs數量變化與預后關聯（引用自PLoS One.2014 Aug 8;9(8)）
入組的1位頭頸部鱗狀細胞癌患者，化療前基線CTCs數量是3個CTCs，連續4個療程的化療后，CTCs數量上升到9個，同期實施的PET-CT所見顯示，在左腋下與脊髓部陰影明顯增加，預示腫瘤進展未得到控制。調整化療方案僅一個療程，CTCs數量從9個下降到5個，充分說明了CTCs即可以作為判斷HNSCC預后的指標，又可以預測治療效果。（圖6）
圖6：CTCs的數量變化與影像學所見的聯合診斷，為修正患者治療方案提供參考意見（引用自PLoS One. 2014 Aug 8;9(8):e103918）
Bozec等【11】利用Cellsearch系統對49例Ⅲ／Ⅳ期ＨＮＳＣＣ患者進行研究時發現，治療前CTCs的檢出率為16%（8/49），NO患者的檢出率5%（1/19），N1-2C檢出率為23%（7/30），但腫瘤分級之間差異無統計學意義（P=0.012）。治療（單純手術或術后聯合放化療）６個月后，13例出現復發或轉移，在這13例患者中有2例治療前檢出了CTCs，統計結果提示治療前與治療后復發、轉移和CTCs的檢出沒有關系，同時研究還發現CTCs不但與患者的性別、是否有煙酒嗜好、腫瘤位置、腫瘤大小等無關，還與腫瘤的分化程度、腫瘤的分期均無關。但是CTCs數量的多少與患者預后及PFS，OS相關。
4.結語
綜上所述,基于外周血CTC檢測的對于頭頸部腫瘤臨床輔助診斷具有重要的臨床意義，其應用前景廣闊，已成為當前腫瘤臨床診療的研究熱點。CTC的富集模式主要有負向，正向，膜過濾與尺寸分離等模式，檢測診斷的主要方法是ICC，iFISH和PCR等。目前CTCs檢測的敏感性與特異性對于在其臨床應用推廣是主要考慮因素，因此進一步提高CTCs檢測的敏感性，集成正負向等多種富集技術和高特異性生物標志物檢測是下一代液體活檢技術的主要特征。通過連續觀察CTcs數量的變化情況和下游分析，為監測腫瘤動態，早期發現/診斷腫瘤的復發轉移，評估治療效果或調整治療方案，為個體化治療提供全面，實時的信息和新的診療思路。
寧波美晶醫療的CTC技術平臺的現狀及展望
國外的CTC檢測公司大部分都有自己獨立研發的檢測平臺或儀器，例如：Cynveniu公司的ClearID微流體平臺，Fluxion Biosciences公司的基于微流體技術以及免疫磁珠的IsoFlux系統；寧波美晶醫療技術有限公司擁有一支經驗豐富、創新能力強的研發、生產管理和市場推廣的人才隊伍。公司主要開發“精準醫療”產品并提供相關服務。具體產品包括：：
醫療器械方面：自主研發的“CellRich?”循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells, CTC）檢測系統及配套試劑，用于檢測血液中的循環腫瘤細胞，進行診斷和監控癌癥病情發展。該系統已有8項發明專利獲得授權，20多項實用新型和軟件著作權授權。項目填補了國內在CTC檢測儀器方面的空白，獲得了2014年“國家重點新產品”稱號。作為同類別中的首創產品，美晶醫療也牽頭制定了相關醫療器械分類標準（分類編碼6841）。目前“CellRich?”系統已經在包括美國達特茅斯醫學院及上海胸科醫院在內的國內外多家知名醫院投入使用。
檢驗服務方面：滿足“精準醫療”對基因檢測的需求，設立了美晶醫學檢驗所，已獲得衛生部頒發的醫療機構執業許可證書和臨床PCR實驗室資質。目前美晶醫學檢驗所已開展臨床細胞分子遺傳學等檢驗服務，包括個性化用藥基因檢測，循環腫瘤細胞檢測，疾病風險基因檢測等多項業務。業務范圍覆蓋華東，華南地區，已在上海，杭州等地設立了區域營銷中心。
液體活檢與醫學影像學診斷互補融合對于腫瘤精準診療具有重要臨床意義， 隨著液體活檢技術的不斷成熟，快速精確篩選和分析血液中完整的循環腫瘤細胞，由腫瘤細胞釋放出的外泌體，和循環腫瘤DNA（ctDNA）等生物標記物，并與下游基因診斷相結合，將有力推動先進的分子診斷技術在個性化醫療中的應用。
參考文獻
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作者簡介
樂飚博士：寧波美晶醫療技術有限公司研發總監。日本名古屋大學工學博士，12年日本腫瘤臨床與研究經歷，擅長基于納米技術的腫瘤早期診斷與治療的放射性醫藥品研發及分子診斷，曾獲得2001年度，日本生物工學學會第一屆優秀論文獎等榮譽，入選2012年度上海市浦江人才，主持重大科研項目5項，參與或協助主持科研項目數十項，發表多篇SCI論文。
宋毅：寧波美晶醫療技術有限公司基因檢測服務部經理。浙江師范大學理學碩士，7年的臨床基因檢測工作經驗，目前主要帶領部門開展相關臨床檢測服務，及開發CTC下游基因檢測項目。
鄔振華：寧波市李惠利東部醫院胃腸外科副主任醫師，外科學碩士，1998年畢業于第二軍醫大學海軍臨床醫學系，長海醫院普外研究生，長期從事胃腸外科臨床、科研工作。浙江省抗癌協會胃腸道間質瘤專業委員會委員，寧波市胃腸道間質瘤專科門診負責人，系中國癌癥基金會（索坦）、中華慈善總會（格列衛）項目注冊醫師。
郝敬鐸：寧波第七醫院副院長，副主任醫師，醫學碩士，鎮海區“121人才”培養對象，鎮海區外科后備人才，鎮海區大外科質控中心秘書，寧波市中西醫學會腫瘤分會委員，寧波市醫學會肛腸分會后備委員，曾赴上海腫瘤醫院、奧地利LKH醫院進修學習，能夠熟練將腹腔鏡技術融入到消化外科（胃腸、肛腸、肝膽胰）領域，對于各類腫瘤的綜合治療（化療、免疫、靶向）有獨到見解。多項科研課題獲廳局級、市區級立項，曾獲“寧波市優秀團干部”“鎮海區十大杰出青年”“鎮海區科普大使”等榮譽。
沈挺博士：寧波美晶醫療技術有限公司總經理，入選浙江省“千人計劃”。 作為主要項目及團隊負責人開發的“新一代癌癥血液檢測生物芯片及系統”項目，獲得了中國科技創業計劃大賽項目組一等獎，中國首屆創新創業大賽優秀企業獎，寧波市首批市“3315計劃”海外高端創業創新團隊最高獎A類，寧波市發明創新大賽獎，及國家科技部中小企業技術創新基金的立項。本科畢業于清華大學自動化系，2004年獲美國斯坦福大學(Stanford University)管理科學與工程博士學位。具備豐富的工程技術研究，高新技術產業化和國際化企業管理的經驗與背景。善于團結帶領團隊，整合資源，帶領公司不斷創新，開拓業務。
張曉晶博士：寧波美晶醫療技術有限公司董事長。入選國家第二批“萬人計劃” 科技創新領軍人才，科技部中青年科技創新領軍人才，浙江省“千人計劃”，美國醫學和生物工程研究院院士（AIBME Fellow），獲得美國國立衛生院（NIH）院長創新研究獎。畢業于美國斯坦福大學，回國創業前任美國著名常春藤盟校(Ivy League)之一的達特茅斯學院(Dartmouth College)正教授， 任生物醫學微納米型器件實驗室主任。學術休假期間，曾任美國美國斯坦福大學訪問教授，上海交通大學 “王寬誠”講席教授。
來源：轉化醫學網（微信號：zhuanhuayixue）
